Analyse von DNA

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

- die Vorgänge bei der Vervielfältigung der DNA durch die PCR sind der natürlichen Replikation sehr ähnlich
- Die Replikation läuft in Zyklen aus drei Schritten ab, die mehrfach wiederholt werden: Denaturierung, Hybridisierung, Polymerisation
-> dadurch wird die Ausgangsmenge an DNA exponentiell vervielfältigt
- bei der PCR werden künstlich hergestellte Primer aus 15 - 30 Nukleotiden verwendet, die zu den Enden des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts komplementär sind
- um Replikation an beiden Strängen gleichzeitig zu starten, setzt man ein gegenläufig orientiertes Primerpaar ein

Denaturierung:
- Erhitzen auf etwa 90 - 100°C, Matrizen-DNA "schmilzt", das heißt, die Wasserstoffbrückenbindungen lösen sich und es entstehen DNA-Einzelstränge

Hybridisierung:
- reaktionsgemisch auf etwa 50°C abkühlen, dann binden die synthetischen Primer an die komplementären Sequenzen der Matrizen-DNA

Polymerisation:
- vom 3'-Ende der Primer ausgehend wird zu jeder Matrizen-DNA durch DNA-Polymerase der Komplementärstrang synthetisiert. Dabei wird vorallem die hitzestabile Taq-Polymerase verwendet, die ein Temperaturoptimum von 72°C besitzt.

- in der Regel reichen 20 - 30 PCR-Zyklen aus um eine für die weitere Analyse ausreichende DNA-Menge zu gewinnen.

 

 

Gelelektrophorese

- Verfahren zur Auftrennung von Makromolekülen wie Proteinen und Nucleinsäuren und deren Bruchstücken
- beruht darauf, dass Moleküle entsprechend ihrer Größe und ihrer ladung in einem elektrischen Feld gerichtet und unterschiedlich schnell wandern
- als Medium dient ein Gel aus einer polymerisierbaren Substanz, zum Beispiel dem Polysaccharid Agarose
- in Elektrophorekammer taucht das Gel an beiden Enden in eine Pufferlösung ein, an die über Elektroden eine elektrische Spannung angelegt wird. Das Gel wirkt wie ein Molekularsieb, in dem große Moleküle mit höherer Ladung hingegen schnell wandern.

 

 

Sequenzierung von DNA

- DNA durch Denaturierung in Einzelstränge aufgespalten, die man mit radioaktiv markierten Primern hybridisiert
- die Probe wird auf vier Reagenzgläser verteilt
- jeder Ansatz enthält die vier DNA-Nucleotide und eine geringe Menge je eines der modifizierten Nucleotide (am 3'-Kohlenstoffatom keine OH-Gruppe)
- DNA-Polymerasen katalysieren in 5' -> 3'-Richtung die Synthese der komplementären Stränge
- intakte und modifizierte Nucleotide werden zufällig eingebaut, sodass die Replikation entweder durchläuft oder an einer bestimmten Stelle der Sequenz abbricht
- in jedem Ansatz bilden sich also unterschiedlich lange DNA-Stränge
- die DNA-Stränge aus den vier Ansätzen werden durch parallele Gelelektrophorese aufgetrennt
- da die Primer radioaktiv markiert sind, lassen sich die Banden durch Autoradiographie leicht sichtbar machen
- aus dem Vergleich der vier Bandenreihen kann man die Basensequenz direkt ablesen
- sie ist komplementär zur Sequenz der DNA-Matrize